干货|3分钟get层析介质清洗策略

2021-10-21 16:00

层析介质的清洗介绍

在生物药物的生产过程中,层析技术是最关键的步骤之一。生物药物通过培养,收集,经过层析介质的纯化,最终得到符合要求的生物药物产品。

在生物制药的分离纯化过程中,培养的物料通过层析介质分离纯化,得到符合要求的目标产品。同时,物料中的杂质也污染了层析介质。这些污染物包括:宿主的蛋白(HCP)、核酸、脂类,培养过程中的代谢产物、内毒素、杂菌,产品聚体,降解片段以及所用试剂中的杂质等。

这些污染物在下一次的分离纯化中将污染目标产品。所以必须去除或将其降低到安全水平。这就是我们所提到的层析介质的清洗 (CIP) 过程。


层析介质所在的纯化工艺中的步骤

在纯化的工艺开发过程中,一般采用三步法纯化工艺:捕获→中度纯化→精纯。

在三步纯化工艺中,不同的纯化步骤,其纯化工作的目的不同。

捕获步骤主要的目的是:从大量的杂质中捕获目标样品,缩小样品的体积,以便于后续的纯化工作。

所以此步骤的工作面临的是物料中有大量杂质。因此此步骤层析介质的清洗需要比较强烈的试剂,因而捕获步骤的层析介质的寿命相对较短。


层析柱的维护操作一般程序

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层析介质的维护是层析介质寿命的关键。层析介质的维护包括层析介质的清洗,消毒,储存。

而层析介质的清洗步骤决定着层析介质的寿命。

优化层析介质的清洗步骤包括以下几个因素

  • 清洗试剂与层析介质的兼容性。即层析介质在清洗时不会与层析介质的骨架发生作用,不会与配基发生作用。

  • 污染物 (物料中的杂质) 必须去除或污染物的水平降低到安全水平,污染物包括:细胞碎片,宿主的蛋白,DNA,内毒素以及污染的杂菌。

  • 清洗试剂与层析介质的接触时间,适合的接触时间确保清洗的效果,但不破坏层析介质。

  • 清洗试剂处理层析介质时的温度。

层析介质的清洗

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详细操作

1、可溶性杂蛋白的清洗方法

a.凝胶过滤介质:一般使用 0.1-0.5M 的NaOH清洗0.5-1 个CV;然后超纯水1-2CV;

b.离子交换介质:2M NaCl清洗0.5 CV;或至少接触10-15 min;

c.疏水层析介质:超纯水 (低离子强度的缓冲液) 清洗2-3 个CV,或使用30%异丙醇清洗2-3个CV;

d.亲和层析介质:根据层析介质的性质使用适当的缓冲液清洗可溶性杂蛋白。

2、沉淀蛋白的清洗方法

a.一般层析介质(GF/IEX/HIC) 的清洗方法:0.5-1M NaOH清洗3-4个CV,然后使用超纯水冲洗 pH至中性;

b.亲和层析介质:使用尿素或盐酸胍清洗1-2个CV。

3、疏水性杂蛋白或脂蛋白的清洗方法

a.一般层析介质(GF/IEX/HIC)的清洗方法:0.5-1M NaOH清洗3-4个CV,然后使用超纯水冲洗pH至中性;

b.亲和层析介质:使用尿素或盐酸胍清洗1-2个CV。

4、脂类杂质的清洗方法

0.5%的非离子去污剂清洗3-4个CV,对于吸附较强的脂类可以优化70%的乙醇或30%的异丙醇清洗。

5、核酸的清洗方法

一般可以选择用1M NaCl加1M NaOH清洗3-4CV,亲和层析介质要根据介质的性质类型选择不同清洗方法。

6、色素的清洗

不同培养液不同来源的色素的清洗过程差异较大,可根据介质的性质及色素的性质进行清洗,碱、酸、有机溶剂、及去污剂,变性剂等,需要尝试。

7、内毒素的清洗方法

内素素的清洗通常用0.5-1M NaOH清洗1-2CV之后,然后使用超纯水冲洗至中性。

亲和层析介质可通过0.5%的非离子型去污剂及有机溶剂的方式清洗内毒素。

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